李昌厚教授:紫外可見分光光度計光度準確度的研究

2021年1月14日 22:25:45 來源: 分析測試百科
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  摘要

  本文討論了紫外可見分光光度計(UV-VISS)的光度準確度(Photometric Accuracy;以下簡稱PA;PA是吸光度理論值A0與實際測量值A之差)的重要性;指出了影響 UV-VISS的PA的主要因素;提出了如何保證或提高UV-VISS的PA的主要途徑。

0、前言

  分析儀器是是集光、機、電、計算機四為一體的、技術密集的、高科技產品,分析儀器及其應用的發展速度非常快[1]。UV-VISS是當今世界上歷史最悠久、使用最多、覆蓋面最廣的分析儀器之一;目前,國際上有數百家從事 UV-VISS生產的廠商,但是,在UV-VISS的PA這個最重要、最關鍵的技術指標的表示方法、給出的數據等方面,絕大多數都存在嚴重問錯誤;首先, PA的表示方法方面,目前,國際上一般都用透過率誤差(△T)或吸光度誤差(△A)表示。有的廠商同時給出△T和△A,但有的廠商只給△T或△A 。作者認為這兩種給法都是可以的。

  但作者研究表明:在單獨給出△T或△A或同時給出△T和△A 的廠商中,絕大多數都沒有搞清△T和△A 的關系,所以給出的數據都是錯誤的(主要表現在給出的△T和△A是相互矛盾的;△T在儀器整個T 值的范圍內都達不到)。目前為止,只有美國 P-E的Lambd9[2]等少數UV-VISS給出的△T或△A或同時給出的△T和△A是正確的。因此,作者曾將這些錯誤稱之為國際性的錯誤。

  作者[5]經過認真的、深入的研究,發現Shimadzu、Hitachi、GBC和中國的大多數廠商,都是只要自認為自己生產的UV-VISS屬于所謂高檔儀器,就在0-100%T的范圍內,將△T都千篇一律寫為:± 0.3%T。同時,對應的△A都寫為:0-0.5Abs內時為±0.002Abs、0.5-1Abs內時為± 0.004Abs。同樣,這也是一個國際性的錯誤。

  作者對這個問題作了深入研究[7] ,從比耳定律出發,推出了一個科學的、復雜的計算公式,并據此計算出七十多張表格。同時據表格作出了一組曲線圖。下面是其中的一張表和曲線圖(詳見:李昌厚等,現代科學儀器,2000年,第一期,第24頁):

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  從上述表和圖,可以清楚的看出:當△T =0.3%T時,若吸光度為0.5A,△A不是0.002A,而是0.0041A;若吸光度為1.0 A,△A不是0.004A,而是0.0128A。

  △T和△A產生上述錯誤現象的主要原因有三個:

  第一,未深入研究,不懂得△T和T0 (透過率真值)的關系,不懂得△A和A0(吸光度真值)的關系,不懂得影響△T和△A的主要因素;

  第二,人云亦云,不管對不對,你這樣寫,我也盲目的這樣寫;

  第三,商業上的需要,人家給的± 0.3 %T ,我如不這樣寫,就擔心會影響儀器的銷售。

  本文將從研發、生產、使用三者的角度,研究、討論 PA 及其有關問題。

一、UV-VISS的PA的重要性

  什么叫 UV-VISS 的PA?簡言之,UV-VISS 對某試樣吸光度的實際測量值與該試樣吸光度真值(實際測量值)之差就叫 PA 。 它是 UV-VISS 可靠性的核心問題,也是使用者最關心的核心問題。

  什么叫可靠性?長期以來,國際上都很重視可靠性這個問題,研究者很多。綜合文獻并結合作者的實踐,作者提出:可靠性可分為狹義和廣義兩種[4]、[5];狹義可靠性是指傳統的可靠性,主要指儀器的設計、制造方面的故障率(含元器件),但是它沒有考慮到使用者的數據準確度、可靠性等這些關鍵問題;而廣義的可靠性則應包括儀器的故障率、準確度、漂移、重復、售后服務等;這樣,既考慮了研發、生產者的問題,也考慮到了廣大使用者的實際使用要求。

  儀器故障率高、安全性差,當然是不可靠。但測量的數據不準確,出了故障不能及時排除,更是不可靠。對用戶來講,一臺UV-VISS,如果分析測試的結果不準確,就是最大的不可靠。所以,任何UV-VISS的設計者、生產者,都希望自己作出的UV-VISS具有很高的PA;任何使用者都希望自己使用的UV-VISS具有很高的PA。

  任何UV-VISS的使用者都要求自己使用的儀器穩定可靠;對用戶來講,所謂穩定,就是漂移小,重復性好。所謂可靠,就是測量結果準確(測量結果誤差小)、故障率小,出了故障能及時排除。穩定可靠,是一切UV-VISS使用者選擇儀器的宗旨。因此,PA應是UV-VISS的設計者、生產者和使用者們共同最關心、最重要的關鍵技術指標。

二、影響 PA 最主要的因素:

  作者經過長期實踐、反復研究,認為影響PA最主要、最關鍵的因

  素,可用下述數學表達式描述:

PA=f(SL、N、BF、SBW)

  式中:PA  -光度準確度(Photometric Accuracy)

   SL  -雜散光(Stray Light)

   N  -噪聲(Nois)

   BF  -基線平直度(Baisline Flat;表征全波段每個波長上的噪聲)

   SBW  -光譜帶寛(Spectral Band Width)

  1. SL:

  UV-VISS 的SL非常重要,它產生光噪聲、直接限制被分析測試試樣濃度的上限。它是目前國際上所有用戶最關心的問題之一。目前,國際上有許多專家學者都在研究SL。下面是 Owen[12] 的研究結果(見圖1):從圖1可明顯看出,不同的SL,偏離比耳定律的程度不同(產生的誤差不同)。

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圖1 不同SL偏離比耳定律

  作者[6]和Shape[5]的研究表明:在試樣濃度為2Abs時測試,若UV-VISS儀器有0.1%的SL,則可產生5%的相對誤差(△A/A0);若在 0.434Abs 處測試,儀器的 SL為0.5% ,則分析結果的相對誤差(△A/A0)就會超過1% ,就不能滿足某些藥物分析工作的要求.

  作者發現:在SL問題上,國外有些廠商對此很不負責任的亂宣傳。如日本的島津,它的2501PC[8] UV-VISS曾經自稱是世界上最高級的 UV-VISS,他們在樣本上寫著:分析測試的試樣的濃度可達 9Abs。而當時美國PE公司推出的Lambda 900、美國Varia公司的Cary500的SL都為8x10-7,,但比較實在的給出測試的吸光度上限為5-6Abs(經作者測試,認為5.5Abs基本可靠)。

  作者從理論上和實踐上對2501PC進行了認真的研究,發現2501PC 樣本上[8]提供的 SL為3ⅹ10-6,根據比耳定律和雜散光理論,作者計算的結果,在9Abs時,該儀器的分析測試的絕對誤差△A在 3Abs以上。這種分析測試結果的可靠性極差,毫無實用價值。所以,2501PC 提供的所謂可測到9Abs是不實用的虛指標,是無意義的。

  作者對SL進行了深入研究;從比耳定律出發,推出了一個很科學、很復雜的計算公式[7],并據此計算出七十幾張表,同時據表作出一組曲線圖(見圖2)。

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圖2 SL對△A/A影響 的研究

  從圖2也可簡明的看出:在試樣為2Abs處測試,若儀器有0.1% 的 SL,則可產生5% 的相對誤差(△A/A0);若在 0.434 Abs 處測試,儀器的SL為0.5% ,則分析結果的相對誤差(△A/A0)就會超過1% ,就不能滿足某些藥物分析工作的要求。

  2 .N :

   UV-VISS的N[9],包括光N和電N;光N由光源的發光強度分布因子所產生,電N由光電倍增管(PMT)、各類電源、放大器等電子學部分所引起。N是UV-VISS 的最重要的關鍵技術指標之一,它直接限制 UV-VISS 的檢測下限(靈敏度)。因此,必須重視對N的研究。

  作者[11]的研究表明:若要滿足藥典的要求(某些藥物分析測試的相對誤差要求為1%),則在試樣的吸光度為0.05Abs時,儀器在測試波長處的N必須達到±0.0005 Abs。而目前,日本和中國的許多UV-VISS 的生產廠家并未重視這個問題。許多廠商的樣本不給出儀器的N(如Shimadzu 的2401PC、2501PC等),這就意味著他們生產的 UV-VISS 的檢測下限是未知的。有的廠商給出了儀器的 N,但是太大,不能滿足藥典的要求。這些問題是使用者挑選UV-VISS儀器時必須重視的問題。

   作者認為,只要認真研究 N,真正認識了N的重要性,并在實踐

  中重視降低N,我國的UV-VISS就會上一個新的臺階。例如:我國的北京普析通用公司,由于重視了對N的研究,他們的 UV-VISS( TU-1901、T10等)的N達到了±0.0004Abs,與目前國際上最高級的UV-VISS之一的美國PE公司的Lambda900[3]處在同一個數量級上(Lambda900的N為±0.0002Abs)。

  綜上所述,UV-VISS的研發者、設計者、制造者在生產儀器時、使用者在挑選儀器時,都必須特別重視儀器的N這個非常重要的技術指標。

  作者對N進行了深入研究,研究的結果見圖3。

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圖3 N對△A/A影響的研究

  3.BF

  BF是指UV-VISS儀器全波段內,每個波長上的N[11],它直接影響UV-VISS的靈敏度或檢測下限和使用范圍,是一個非常重要的技術指 標。是使用者挑選和使用UV-VISS時,特別要重視的技術指標之一。它也是目前國內外有關的科技工作者,還未引起足夠重視的技術指標之一。

  因為整機的N是在500nm處測試的,它只能表示500nm處的N;而用戶在使用儀器時,一般都不只是用在在500nm,并且,大多數用在紫外區。所以,每個波長上的N,特別是紫外區的各個波長上的N,就顯得特別重要。我國有好多廠商給出的BF為±0.004Abs;作者認為BF為±0.004Abs的UV-VISS儀器,遠不能滿足我國藥典要求相對誤差為1%的藥物分析工作要求。作者作DNA分析測試時,要求相對誤差為1%,但試樣的吸光度常在0.08-0.1Abs。開始,曾想用某某儀器,因其BF為±0.004Abs,分析相對誤差為1.5%,不能滿足相對誤差為1%的要求,故改用±0.001Abs的儀器(TU-1901),完全能滿足相對誤差為1%的要求,效果很好。

  4. SBW:

   UV-VISS 的SBW非常重要,它是影響 UV-VISS的PA的主要因素之一。T.Owen 的研究結果[12]見圖4,它能清楚的說明這個問題;用1nm的SBW,能分出兩個很好的峰。用20nm的SBW,兩個峰就變為馬鞍形,如用50 nm的SBW,則兩個峰變為一個峰。由此可知,SBW多么重要。

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圖4 SBW對PA的影響

  SBW對PA的影響,還可從下面的例子看出:作者曾經在5nm的SBW時,測試細胞色素C,結果產生30%左右的誤差。作者還發現:在SBW=2nm時,測試細胞色素C,會產生10%左右的誤差。只有SBW為0.3nm時,測試結果才能真正反映出細胞色素C的實際的吸光度值(1%以內的誤差)。

   又如:青霉素鈉、青霉素鉀也是如此;我國藥典曾經規定:作青霉素鈉、青霉素鉀時,要求SBW=1nm。其實這也是不對的;作者的實踐表明:在藥典規定的條件下,SBW為2nm時,測試值為0.805Abs;在SBW為1.0nm時,測試值為0.825Abs和 SBW為0.3nm時,測試值為0.865Abs。SBW為0.2nm時,測試值為0.845Abs .0.3nm和1.0nm相差0.04Abs相對誤差為4.7%。這足以說明SBW的重要性。所以,必須要非常重視對 UV-VISS 的SBW的選擇。特別是藥檢工作者,在挑選 UV-VISS 時,更要注意 SBW。一般來講,固定 SBW的UV-VISS,不宜用在藥檢和科研工作中,否則,會產生很大的分析誤差。因此,制造者、使用者都必須高度重視SBW 的問題。

  目前,我國還有不少藥廠用 SBW=5nm或 更大的、固定SBW的 UV-VISS(如752、753、754等)作為質量控制儀器,這是不對的,應該改用 SBW ≤2nm 的UV-VISS才對。云南保山地區藥檢系統某某單位曾經買島津的UV-1206 UV-VISS作質檢,該儀器的SBW=5nm;所以UV-1206根本不能用作藥檢。藥典為何要規定用2nm的SBW?這是有科學根據的;因為A.Owen[11]的研究表明:若SBW/NBW(即光譜帶寬/自然帶寬)= 0.1時,則能滿足世界上99%以上的試樣的分析,其分析準確度可達到99.5%。而地球上有機試樣的自然帶寬一般都在20nm 左右。所以,如果 UV-VISS的SBW=2nm,則此時SBW)/20(NBW=0.1,基本上能滿足99%的藥品分析檢驗工作的要求。并且,分析測試的準確度為99.5% [11]。所以,中國和許多國家的藥典都規定用于藥品質控的 UV-VISS,必須要求SBW≤2nm,就是這個道理。

三、如何保證或提高 UV-VISS 的 PA

  1. UV-VISS儀器的研發者(設計者)必須做到五個認真:

  ① 認真開展有關 PA 的基本理論研究;重視儀器學理論[13] 、真正搞清 △A 、△T的關系,必須給出正確的PA值。

  ②認真開展對PA、SL、N、BF 、 SBW 等相互關系的研究,真正搞清其相互關系和對分析誤差的影響,正確給出這些技術指標。

  ③認真開展影響 PA 的主要因素的研究;并在實踐中用來指導生產和使用工作。

  ④認真開展 PA 測試方法的研究;準確的測出 PA。

  ⑤認真與使用者溝通,不斷了解用戶對 PA 的要求。

  2 .生產者應該做到五個必須:

  ① 必須對元器件進行嚴格篩選(含光源、光柵等光學元件和PMT、集成塊等電子元器件),以保證整機質量、保證PA準確可靠。

  ② 必須有嚴格的生產工藝。特別是裝校工藝和質量檢驗工藝。

  ③ 必須對儀器的性能指標進行全面測試(含、SL、N、SBW、BF、PA、比色皿配對等)。

  ④ 必須對元部件作全面測試;含各類電源、放大器、電光源系統等的性能指標測試。

  ⑤ 必須與用戶保持聯系,加強售后服務。

  3 .使用者做到五個認真:

  ① 認真學習儀器學理論[13],了解儀器指標與分析誤差的關系,了解儀器基本結構,掌握主要技術指標的基本測試方法,經常自己檢測儀器,工作中認真選擇儀器條件,力爭把儀器用在最佳狀態。

  ② 認真按說明書的要求操作儀器,切不可違反說明書進行操作。

  ③ 認真進行儀器的日常維護,保持室內清潔,注意控制室內溫度和濕度。

  ④ 認真作好試樣的前處理,減少因試樣的前處理而帶來的比耳定律偏離。(如防止試樣光解、污染等)

  ⑤ 認真總結使用儀器的經驗。經常與生產廠保持聯系。經常參加分析儀器行業的學術交流會。

四、結束語:

   PA是UV-VISS 最重要的關鍵技術指標之一;SL、N、BF 和 SBW 是影響 PA的最主要的因素。所以,重視 UV-VISS 的PA的研究,首先就應特別重視 UV-VISS 的 SL、N、BF 和 SBW 的研究。只有研發者、設計者、生產者、使用者共同努力,認真研究SL、N、BF 和 SBW,才能真正保證提高我國 UV-VISS的PA。

  參考文獻

  [1]李昌厚,我國分析儀器及其應用的發展現狀和最新進展,儀器信息網,2019/6/6

  [2]李昌厚,透光度誤差與吸光度誤差關系的研究,現代科學儀器,25,1,2000

  [3]P-E, Lambada9UV/VIS/NIR Spectrophotometer,Order No.B-457

  [4]李昌厚,提高可靠性,邁上新臺階,科學時報(科學裝備B1版2000年11月

  [5]李昌厚,論中國分析儀器的十大關系,科學時報(科學裝備B1版),2001年5月

  [6]M.R.Shape,Stray Light of UV/VISS, Analytical Chemistry, Vol.56, No.2,p339A,1984

  [7]李昌厚,雜散光與吸光度相對誤差關系的研究,中國儀器儀表學報,53,1,2001.

  [8] Shimadzu,2401PC/2501PC 紫外可見分光光度計(樣本)

  [9]李昌厚,略論比耳定律及其有關問題,光學儀器,4,20,1984。

  [10]Tony Owen, Fundamentals of UV-Visible Spectroscopy, Printed in Germany 09/96, (HP puplication number 12-5965-5123E), P106, 1996

  [11] LI chang hou,’99 Industrial instrumentation and automation conference,Internationalinstrumentation and automation(specialsupplement) ,p257,1999.

  [12] A. Owen ,The diode-array advantage in UV/VISS,Hewllet Packrd,PrinnTED in Germany,03/88,p15.

  [13]李昌厚,儀器學理論與實踐,北京:科學出版社,2008。

  作者簡介

  李昌厚,男,中國科學院上海生物工程研究中心原儀器分析室主任、兼生命科學儀器及其應用研究室主任、教授、博士生導師、華東理工大學兼職教授,終身享受國務院政府特殊津貼。

  主要研究方向:長期從事分析儀器研究開發和分析儀器應用研究。主要從事光譜儀器(紫外吸收光譜、原子吸收光譜、旋光光譜、分子熒光光譜、原子熒光、拉曼光譜等)、色譜儀器(液相色譜、氣相色譜等)及其應用研究;特別對《儀器學理論》和分析儀器指標檢測等方面有精深研究;以第一完成者身份,完成科研成果15項。由中科院組織專家鑒定,其中13項達到鑒定時國際上同類儀器的先進水平,2項填補國內空白;以第一完成者身份獲得國家級和省部級科技成果獎5項(含國家發明獎1項);發表論文183篇,出版專著5本;現任中國儀器儀表學會理事、《生命科學儀器》付主編;曾任中國儀器儀表學會分析儀器分會第五屆、第六屆付理事長;國家認監委計量認證/審查認可國家級常任評審員、國家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大儀器及其應用專項的技術專家組成員或組長、上海市科學儀器專家組成員、《光學儀器》副主編、《光譜儀器與分析》副主編、上海化工研究院院士專家工作站成員等十多個學術團體和專家委員會成員等職。

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