蛋白回收率能夠達到95%以上?看看大咖們的超濾秘笈!

小師弟最近接了一個新項目,根據實驗室師兄師姐的經驗傳授,選擇了1/3截留分子量的超濾膜孔徑截留新得到的重組抗體蛋白,但是卻總感覺回收率不佳……

是不是這個批次的超濾管有問題?于是小師弟換了批次,結果仍然回收率不高。最后,小師弟求助了膜過濾和超濾的專家小賽。

根據經驗,小賽建議他試用同樣截留分子量的Hydrosart和RC膜材質的超濾管,結果,回收率果然就有了很大的提升!

由于超濾管使用不恰當或是超濾知識缺乏引起的問題,簡直成了實驗汪們蛋白實驗不成功、效率低下的最常見原因之一。

上周的這些超濾離心管的使用問題你都遇到過嗎?一經發出,好多小伙伴紛紛下載和申請試用。除此之外,還有哪些問題困擾著實驗小白呢?

Q

有時候我用超濾離心管連水都離不下來,可能的原因是?

A

超過濾薄膜含有微量甘油。如果出現這種情況,先用0.1 N NaOH 清洗再離心。最后用緩沖液或去離子水水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用,如暫時不用,請保持潤濕狀態,避免重新干燥。另外, 有些水的水質本身雜質較多,或是不同水機對水的處理效果有差異,這個時候可以檢查是否水機工作正常,然后用 0.2um 的針頭濾器過濾水,然后再進行超濾,效果可能會好很多!

Q

在濃縮過程中如何減少蛋白質降解?

A

在濃縮過程中,不均衡的蛋白質、pH/樣品緩沖液條件以及高剪切應力通常會導致降解產生。同樣的,蛋白質的形狀越呈線性,高離心力對結構的不利影響就越大。如果蛋白質呈線性、濃縮時間較慢,且離心力低于建議的最大值(約 50 % 較好),則影響會較小。對于更多的球狀分子,建議使用最接近最小樣品量的裝置,這樣可確保更大的表面積、減少堵塞概率并增加樣品上的力。

盡管如此,您還應注意:如果您的蛋白質超濾膜材質選擇不合適,或者您的蛋白質具有“粘性”,則表面積越大,非特異性結合的比率就會越高。諸如Vivaflow? 膜包等實驗室用切向流膜包可為樣品提供真正的平行流路,能夠進一步確保最小的剪切應力。應注意的是,一般的攪拌細胞容器會施加相對較大的剪切應力。

對于pH/緩沖液條件,一旦選擇了最優的緩沖液pH 條件,就應該在整個濃縮置換過程中維持這個條件。使用Vivaflow? 裝置和離心式Vivaspin? 20 可以輕松進行緩沖液置換,即使濃度增加也可以保持正確的緩沖液平衡,您也可以在需要時添加新的緩沖液。

Q

可以用超濾管控制濃縮倍數嗎?

A

首先,Vivaspin? 超濾管有最小回收體積,保證至少回收 30 μl的樣本,并且不會讓過長的離心時間導致樣品干燥。另外,Vivaspin? Turbo 系列的尖角死體積回收器可以讓小體積樣品得到最大的回收。

另外,如果需要濃縮一定的倍數,使用超濾管也可以直接完成,不需要額外的步驟。首先,預先計算外管液體達到濾過孔的刻度線的位置需要的體積,然后減去樣品要濾出的體積,就是需要預先加入外管的緩沖液的體積。先在外管中加入計算得到的緩沖液,待濾出液的體積流入外管緩沖液中,使液面達到濾出孔,則樣品不再濃縮,濃縮倍數得到了固定,樣品濃縮就是那么簡單。

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